Jelentős felfedezés lett az évtizedes munka megérdemelt eredménye

2020. augusztus 31.

Aki szeret nagy felfedezésekről olvasni, a sok eltérő mozzanat mellett egy közös dolgot biztosan talál. A "heuréka" pillanat nem történik akárkivel, "véletlenül" senki nevéhez nem társítanak nagy felfedezést. Kísérletes tudományokban azonban, különösen manapság, még a legnagyobb elméknek is szükségük van nem is akármilyen tagokból álló csapatra. A KOKI-ban a sikeres csapatépítésre is több példa van, és intézetünk első ERC pályázat győztesének, Katona Istvánnak csapata is ide tartozik. Egy jó csapat egyik alapvető tulajdonsága, hogy tagjai képesek éveken át vállvetve dolgozni, mert hisznek abban, hogy jelentős felfedezés tárulhat eléjük. Most megjelent munkájuk története erről is szól.

- A Nature Communicationban megjelent cikketek címe igazán nem bonyolult (magyar fordításban kb.: Az ABHD4 által közvetített fejlődési anoikis védi az embrionális agyat) de megértéséhez tudni kell, mi az az ABHD4, és főképp, mit jelent az anoikis?

István:
- Kutatócsoportunk az ERC pályázat segítségével indult 2009. novemberében. Legfontosabb célunk olyan enzimek és receptorok vizsgálata volt, amelyek evolúciósan vagy biokémiailag, kapcsolódnak az endokannabinoid rendszerhez. Tíz évvel ezelőtt ezekről a fehérjékről létezésükön kívül szinte semmit nem lehetett tudni, mivel a közismert idegrendszeri jelenségek többségének molekuláris kulcsszereplői már régóta ismertek voltak, ezért bíztunk abban, hogy ezeknek az ismeretlen fehérjéknek a kutatása akár új biológiai jelenségek feltárásához vezethet, és új kórélettani folyamatok, valamint ezek terápiás célpontjainak megismeréséhez is hozzájárulhatunk.

László Zsófia, a cikk egyik elsőszerzője, szeptember 15-én fogja védeni PhD fokozatát. Tudományos diákkörösként kezdett a csoportban dolgozni.

- Te hogyan emlékszel a kezdetekre?

Zsófi:
- A projekt kezdetén annyit tudtunk biokémiai kísérletekből, hogy az ABHD4 egy potenciális résztvevő az anandamid bioszintézisében. Ezért kíváncsiak voltunk, vajon milyen szerepet játszhat a CB1 receptor által mediált szinaptikus transzmisszióban. Első kísérleteinkben felnőtt egér agyban próbáltuk meg lokalizálni az Abhd4 mRNS-t, azonban nem találtunk meggyőző expressziót.

- És ekkor jött Lele Zsolt ötlete, akivel megosztjátok azt az igen értékes elsőszerzőséget!

Zsolt:
- Igen, ekkor besegített az én fejlődésbiológus múltam, megvizsgáltuk az embrionális agyat, ahol viszont nagyon erős és specifikus Abhd4 expressziót fedeztünk fel a laterális és harmadik agykamrák falában lévő ventrikuláris zónában. Igazából ez volt az a ”Na, ez nem lehet véletlen” Heuréka-pillanat.

Zsófi:
- Ezután különböző embrionális és korai posztnatális életkorokban vizsgáltuk meg az ABHD4 enzim előfordulását, és mivel térben és időben konzisztens expressziós mintázatot tapasztaltunk, ezért kíváncsian vártuk, milyen anatómiai és funkcionális defektusokat fogunk találni az Abhd4 génkiütött embriók agykérgének vizsgálatakor. Meglepetésünkre azonban semmilyen lényegi különbséget nem találtunk!

- És mi segített át benneteket ezen a holtponton?

Zsolt:
- Az az ötlet, hogy fordítsuk meg az egészet, és nézzük meg azt, mi történik a migráló piramissejtekkel, ha az érésük folyamán fenntartjuk az ABHD4 expressziót, amiről tudtuk, hogy alapesetben osztódás után rögtön kikapcsol a differenciálódó sejtekben. Ekkor kezdtük el az akkoriban még Magyarországon egyedülállónak számító in utero (méhen belüli) elektroporációs kísérleteinket, aminek aztán Zsófi igazi szakértője lett.

Zsófi:
- Már első eredményeink is nagyon izgalmasak voltak, mivel az ABHD4 fehérje jelenléte nagyon markáns radiális migrációs defektust okozott. A sejtek elvesztették a migrációra jellemző, bipoláris morfológiájukat is, összementek, lekerekedtek, egyszóval a sejthalált megelőző állapotra jellemző alakot öltöttek. TUNEL festéssel, mely képes a fragmentált (széttöredezett) DNS-t megjeleníteni, megbizonyosodtunk arról, hogy az érintett sejtek elpusztulnak. A következő nagy logikai lépés az ABHD4 által kiváltott sejthalál létjogosultságának megértése volt.

- Kaphatnánk egy rövid ismertetőt erről a titokzatos ABHD4-ről?

István:
- In vitro, azaz kémcsőben, homogenizált sejteken végzett kísérletek eredményei alapján tudjuk, hogy az ABHD4 enzim egy olyan szerin-hidroláz, mely potenciális szerepet vállalhat az anandamid nevű endokannabinoid szintézisének útvonalában. Amikor 2010-ben ezt a kutatási programunkat elindítottuk, mindössze 2 cikk volt csak a PubMed-en erről az enzimről, és azóta sem jelent meg olyan tanulmány, amely ennek a fehérjének in vivo élettani vagy kórélettani szerepét célzottan vizsgálta volna.
Zsófi és Zsolt rengeteg kísérleti munkájának köszönhetően aztán kiderült, hogy a klasszikus radiális glia progenitor sejtek feladataihoz nem szükséges az ABHD4 enzim. Ez komoly fejtörést okozott, hiszen miért éri meg egy sejtnek nagy mennyiségben termelni az Abhd4 mRNS-t, ha nem használja, az ABHD4 fehérje túltermeltetése pedig sejthalált okoz?

Zsolt:
- Mivel az osztódó sejtekben jelen lévő ABHD4-nek semmilyen funkciója nem volt a normális egyedfejlődésre, ezért felmerült a gondolat, hogy zavarjuk meg valahogy az idegsejt-képződési folyamatot. Az agykéreg fejlődése során a ventrikuláris zónában születő neuroblasztoknak le kell válniuk az anyasejtről - ez az ún. delamináció - mielőtt hosszú, több lépésből álló radiális migrációjukat megkezdenék. A folyamat molekuláris szinten szigorúan szabályozott, és nagyon hasonló a rákos sejtek metasztázist képző jelenségéhez.

Zsófi:
- Azt már tudtuk, hogy normál körülmények között, ha egy epitheliális sejt elveszíti a környezetéhez való kapcsolatát, szelektív apoptózis útján eliminálódik a szöveti környezetből, nehogy metasztatikus vagy fibrotikus elváltozás alakuljon ki. Ezt az adhézió hiányában kialakult programozott sejthalál típust nevezik görögből származtatott néven anoikisnek, azaz "otthontalanságnak". Azonban mind a frissen született és elszakadó neuroblasztok, mind a metasztázist okozó rákos sejtek képesek valahogyan „megszökni” a sejthalál elől, ami arra utal, hogy az egészséges agykéregben komoly ellenőrző funkció van, ami metasztázis esetén hiányzik. Az ABHD4 specifikus jelenlétét és sejthalált indukáló tulajdonságát figyelembe véve alkottuk meg azt a hipotézist, hogy az ABHD4 egy ellenőrző pont lehet a sejtek érése során, ami kiszűri a több milliós sejtosztódásból azokat a sejteket, melyek funkcionálisan vagy morfológiailag képtelenek elindulni a radiális migrációra, és így elhárítja az olyan fejlődési rendellenességek kialakulását, mint például a periventrikuláris heterotópia.

István:
- Kísérleteink igazolták hipotézisünket, hiszen az ABHD4 enzim jelenlétében ezek a sejtek kiszakadtak a ventrikuláris zónából, majd elpusztultak, míg hiánya esetén ugyan kiszakadtak, de nem pusztultak el. Az ABHD4 tehát nélkülözhetetlen molekuláris szereplő a sejthalálhoz szükséges fejlődési anoikis jelenségében.

- Sok éven át dolgoztatok. Előfordult, hogy úgy gondoltátok, esetleg nem érdemes már ezt az utat folytatni?

Zsófi:
- Pont a minap került kezembe a TDK-s jegyzőkönyvem, melyben a legelső kísérlet dátuma 2009. július 17. Én ekkor készítettem először ABHD4 ribopróbát, amivel elindultam ezen a nagyon hosszú és izgalmas úton. Bár személy szerint sokszor éreztem, hogy a projekt zsákutcába vezet, de mindig jött egy olyan logikai fordulat, ami tovább lendített minket.

Zsolt:
- Nagyon szerencsések voltunk, hogy ketten csináltuk végig ezt a projektet, mert valamelyikünk mindig tovább tudta lökni a szekeret. És azt is tudni kell, hogy a fejlődésneurobiológia (legalábbis egérben) „lassú” tudomány, egy-egy kísérleti elképzelésről hetekig is eltarthat, mire kiderül, jó-e vagy nem.

- Elsősorban miért érte meg az a rengeteg munka-idő ráfordítás? Mi bizonyítja számotokra, hogy a fejlődő idegrendszer számára alapvető, nagy jelentőségű folyamatot fedeztetek fel?

István:
- Sem a biológiai jelenség, sem az ABHD4 szerepe nem volt ismert, nem álltak rendelkezésre cikkek, más kutatócsoportok korábbi eredményei, amelyekre támaszkodva gyorsabban előre tudtunk volna haladni. Ez az egyik oka annak, hogy ez a kutatási program ilyen sokáig tartott. A másik ok, hogy lépésről lépésre haladva sok új módszer, protokoll beállítására volt szükség.
Arra nagyon büszkék vagyunk, hogy miután sikerült a fejlődési anoikis jelenségét és az ABHD4 nélkülözhetetlen szerepét a fejlődő agykéregben megmutatnunk, újabb egy év munkával, mielőtt a tanulmányt publikálásra beküldtük, klinikai jelentőségére is tudtunk egy példát mutatni.
Ehhez Zsófi javaslatára a magzati alkoholszindróma modelljét választottuk, mert közismert, hogy a túlzott anyai alkoholfogyasztás a radiális glia progenitor sejtek elpusztítása miatt mikrokefáliát (kisfejűséget) eredményez, az alkohol pedig önmagában károsítja a sejt-sejt közötti kapcsolóstruktúrákat. Zsófi két kezelési protokollt is kidolgozott, és mindkettőben azt tapasztaltuk, hogy az alkohol valóban sejthalált vált ki vad típusú állatokban, az ABHD4-KO (génkiütött) egerekben ezzel szemben nem tapasztaltunk sejthalált.

Az anyai alkoholfogyasztás megnövekedett sejthalált okoz a vad típusú embriók agyában (a és c panel). Az Abhd4 génkiütött állatokban (d panel) ez a növekedés nem látható, ami bizonyítja, hogy az Abhd4 jelenléte szükséges a sejthalálszint emelkedéséhez.

Zsófi:
- Szerintem a kutatói létforma megköveteli az örök hitet a biológiai rendszerek törvényszerűségeiben. Tudtuk, hogy nem véletlenül van ennyire specifikus helyen az általunk vizsgált fehérje, és nem véletlen az sem, hogy funkciója helyhez és időhöz kötött. Megértésének dinamikája a mi technológiai felszereltségünktől és szerencsénktől is függött, de sosincs kidobott idő, csak rossz kérdés, bár még abból is lehet tanulni, néha többet is, mintha egyből kijönne az eredmény. Számomra a legjelentősebb áttörést az volt, amikor delaminációt okozva nem találtunk sejthalált az Abhd4-/- génkiütött állatokban. Máig emlékszem, ahogy ott álltam Zsolt mellett a mikroszkópnál és kérdeztem : „Na, mit látsz? Van valami változás?” Zsolt felnézett, és csak annyit mondott: „Ezt most megcsíptük”.

A folyamat jelentőségét számomra két dolog bizonyítja.
Az elsővel kapcsolatban az elmúlt években számos cikk megjelent. Már tudtuk, hogy a sejthalál fontos szabályozó folyamat az embrionális fejlődés során, hozzájárul az egyensúly megtartásához az osztódások és a végső neuron szám között. Arról azonban nem volt információnk, hogy egy patofiziológiás esemény során hogyan védekezik a rendszer, hogyan tudja kivédeni a hibás delaminációból adódó fejlődési rendellenességeket.

A második, hogy felfedeztük egy eddig ismeretlen, az endokannabinoid rendszerhez köthető fehérje funkcióját, és ez nagymértékben kiszélesíti az endokannabinoid rendszerről alkotott képünket és új funkcionális utakat nyit meg. Az egyik ilyen izgalmas kérdés például az ABHD4 által készített vagy lebontott lipid, és annak molekuláris célpontja, receptora.

Zsolt:
- Zsófi és István válaszaihoz csak azt tehetem még hozzá, hogy most, hogy tudjuk, valami alapvető fejlődés-neurobiológiai szabályozó-jelenséget fedeztünk fel, a következő nagy kérdés az, mennyire általános jellegű ez a folyamat, illetve, hogy mi is pontos molekuláris mechanizmusa.
Munkában tehát nincs hiány, és reméljük, a különböző pályázati források bírálói is így gondolják, és lehetővé teszik a munka folytatását.

- A cikk első verzióját a biorxiv.org-ra 2019. dec. 17-én töltöttétek fel, azaz nyolc hónapja. Mi történt ezalatt?

Zsófi:
- A decemberi feltöltést követően februárban megkaptuk a bírálói kéréseket, teljesítésükre pedig kaptunk 3 hónapot. Aztán nem várt fordulatként, mondhatni a legrosszabbkor, beütött a világjárvány. Szerencsére, Zsolttal minden kért kísérletet és elemzést el tudunk végezni ez alatt a három hónap alatt. A visszaküldött verzióra mindkét bíráló áldását adta, sőt, mindketten kiemelték, hogy most már publikációra alkalmas. Ezt nagyon jó érzés volt olvasni, főleg az ezt megelőző kőkemény 3 hónap után!

Szimbolikus hagyomány a Katona-csoportban, hogy az első és utolsó szerzők a kézirat beküldésekor együtt nyomják meg a "submit" gombot

István:
- Minden tanulmányunk esetében a legfontosabb publikációs cél a lehető legtöbb olvasóhoz való eljutás, hogy rengeteg munkánk és a befektett anyagi erőforrás tudományos hatása a lehető legnagyobb legyen. Mivel a Nature Communications nyílt hozzáférésű (Open Access), ráadásul magas nemzetközi presztízse van, ezért nagyon örültünk, amikor a szerkesztője azonnal kiküldte bírálni kéziratunkat. Az újabb nagy örömet pedig az ismeretlen bírálók véleménye okozta. Egyikük méltatása szerint “új koncepció a fejlődés-neurobiológiában” míg másikuk azt írta, „új utakat nyit az idegsejtek keletkezésének kutatásában”.
Több évtizedes pályafutásunk alatt egyikünk sem kapott még ehhez hasonló értékelést. Persze a Twitteren megjelenő “beautiful new study” megjegyzések, dicsérő hozzászólásokat is nagyon jó volt olvasni. A legnagyobb örömet azonban az okozza majd, ha azt tapasztaljuk, hogy sok versenytárs megjelenik, mert annyira értékesnek tartják eredményeinket, hogy tovább gondolják, tovább kutatják a témát, és olyan módokon hasznosítják felfedezésünket, melyek nekünk eszünkbe sem jutottak volna.

- Egy ekkora felfedezés és bizonyítása nem csak hosszabb időt, de több munkatársat is igényel általában.

István:
- Ez a kutatási program sokkal nehezebb és hosszabb volt a szokásosnál, és nagy segítséget jelentett, hogy nem kellett a részeredményeket külön-külön kisebb újságokban megjelentetnünk, hanem a KOKI vezetősége részéről éreztük a személyes bizalmat, hogy a kockázatosabb, de nagyobb tudományos hatással kecsegtető úton haladjunk. Több más csoporttag (Miczán Vivien, Mógor Fruzsina és Zöldi Miklós) speciális módszertani segítsége, és együttműködő partnereink (Ben Cravatt, Kacskovics Imre, Ken Mackie és Gabriel Simon) antitestjei és egérvonala is sokat jelentettek az eredmény elérésében.
De mindehhez persze elsősorban Zsófi és Zsolt hatalmas munkabírására, elképesztően kitartó hozzáállására, a zsákutcákból kivezető “keljfeljancsi”-attitüdjére és kockázatvállaló képességére volt szükség.
Bízunk benne, hogy felfedezéseik alapmunkává válnak a fejlődésbiológia területén, és hatással lehetnek akár távolabbi élettudományi kutatási területeken is, mint például a tumorbiológia, hiszen az ABHD4 a híres tumor szupresszor, a p53 által szabályozott gén.

- A csoport valamilyen módon folytatja ezt a témát is?

Zsófi: Természetesen folytatjuk a munkát, az upstream és downstream molekuláris játékosokat is szeretnénk megtalálni, és felfedni a teljes útvonalat mely, a fejlődési anoikist szabályozza. Részemről azonban ez a munka lezárul, mert októbertől Skóciában folytatom kutatómunkámat posztdoktorként.

Zsolt:
- Bár Zsófi elvesztése nagyon nagy űrt hagy maga után, de mi megpróbáljuk folytatni a projekt eddigi szép ívét, és új emberek bevonásával minél hamarabb megtalálni a további válaszokat.

István:
- Természetesen folytatjuk, hiszen vállalt kutatási célunk, hogy a szinaptikus endokannabinoid jelpálya molekuláris szerveződésének lépésről lépésre történő feltárásához hasonló módon, a fejlődési anoikis jelenségében is felfedezzük az endokannabinoid rendszer további fontos molekuláris szereplőit, lipid mediátorokat, metabolikus enzimeiket és receptoraikat. A jó hír, hogy módszer- tani protokolljaink mostanra kialakultak, és vannak nagyon ígéretes jelöltjeink. Bízunk benne, hogy alkotóműhelyünk a következő években ennek a kutatási programnak a megvalósítására tud majd összpontosítani a KOKI-ban.

A munka elérhetősége:
*László Z, *Lele Z, Zöldi M, Miczán V, Mógor F, Simon GM, Mackie K, Kacskovics I, Cravatt BF and Katona I (2020) ABHD4-mediated developmental anoikis safeguards the embryonic brain. Nature Communications, DOI: 10.1038/s41467-020-18175-4.
https://www.nature.com/articles/s41467-020-18175-4