Új elektronmikroszkóp, új lehetőségek

2017. július 6. Kittel Ágnes

Minden kutató álma részt venni egy jelentős felfedezésben, meglátni valamit, amit addig még soha, senki sem. És aki mikroszkópokkal dolgozik, annál ez akár szó szerint is vehető - így egy új mikroszkóp érkezése az Intézetbe különösen nagy esemény számára.

Szerencsésnek érezhetjük magunkat, hiszen a Nikon-KOKI Mikroszkóp Központban is csúcstechnológiás módszereket használhatunk 6 mikroszkópos rendszerünk segítségével, és ez évtől elektronmikroszkópjaink száma is négyre emelkedett. A legmagasabb kívánalmaknak is megfelelő berendezések pedig nem csak a munkát, de még a munka eredményének nemzetközi szinten való elfogadtatását, a legjobb tudományos folyóiratokban való közzétételét is támogathatják.

A KOKI-ban Nyíri Gábor tudhatja az elektronmikroszkópokkal kapcsolatban a legtöbbet, hiszen az elmúlt bő 5 évben rá hárult 2 új elektronmikroszkópunk (EM) beszerzésének ezernyi tennivalója, benne a pályázatok kezelése, a készülékek kiválasztása, a cégekkel való tárgyalás és áralku, valamint a komoly telepítési igényű készülékek elhelyezésének megszervezése. Továbbá, az ő feladata volt végiggondolni azt is, mi minden szükséges ahhoz, hogy a KOKI hamarosan felépülő új épületében minden igényt kielégítő EM központ is lehessen. Ha valakinek ezekkel a mikroszkópokkal, az elektronmikroszkópos technikákkal és a mikroszkópokon kívül is szükséges egyéb műszerekkel kapcsolatban kérdése van, hozzá bátran fordulhat.

- Az intézetben 2012-ben két elektronmikroszkóp volt, a kb. két éve üzembe helyezett új transzmissziós mikroszkóp (TEM) után pedig beszerzésre került egy modern pásztázó elektronmikroszkóp. Mi indokolta egy újabb beszerzését és – elektronmikroszkópok esetében majd kétszázmillió forintos nagyságrendről beszélünk- mi tette a beruházást lehetővé?

- Az intézet korábbi két elektronmikroszkópja már nem fiatal. Hitachi mikroszkópunk huszonegynéhány éves volt, így javítása lassan gazdaságtalanná vagy lehetetlenné válik. Részben ennek pótlására pályáztunk 2012-ben MTA forrásból egy új transzmissziós mikroszkópot (TEM). Ez a FEI Tecnai G2 Spirit készülék nagy technikai előrelépést is jelentett, mivel a mikroszkóp normál működése mellett elektron tomográfiás vizsgálatokra is alkalmas, példátlanul nagy felbontású 3 dimenziós rekonstrukciót téve ezzel lehetővé.

Látván, hogy hosszú évekre biztosítottá váltak az intézetben a nagy hagyományokra épülő TEM vizsgálatok, belevágtunk egy gyökeresen új technológiai hátterű EM technika meghonosításába. Sikeres tárgyalásokat követően, 2016-ban igen kedvezményes feltételekkel sikerült beszereznünk a világ első FEI APREO VolumeScope Block-Face Scanning EM készülékét, melyet egyrészt a MTA Infrastruktúrális keretének, másrészt a Nemzeti Agykutatási Programnak a támogatásával sikerült megvásárolni.

- Miért éppen ezt, a sok modern EM közül? Mi az előnye a másik hárommal (Hitachi/JEOL TEM/FEI TEM) szemben? Mutasd egy kicsit be, kérlek.

- A klasszikus TEM minták előkészítése, metszése, sorozatfényképezése, és rekonstrukció esetén pedig a fényképek illesztése hosszadalmas. Ezek gyorsabban és pontosabban elvégezhetők bizonyos Scanning EM-ok (SEM) segítségével. Ezekből többféle is létezik. Vannak, amelyek szalagra veszik fel az EM metszeteket, majd azokat pásztázzák a SEM készülékben. Mások egy ionsugár segítségével metszik a szövetblokkot - sajnos csak nagyon kicsi területen - és metszetenként pásztázzák azt a SEM készülék belsejében. Intézeti idegtudományi kérdéseinkhez a legjobban az u.n. Block-Face Scanning EM általunk vásárolt típusa illik.

A működés elvben egyszerű. A gyantába ágyazott szövetblokk a készülék vákuumterébe kerül, majd felszínéről egy pásztázó elektronnyaláb képet készít. A kép rajzolata ugyanolyan, mint a klasszikus TEM készülékekben, csak itt a nehézfémek nem kitakarják az elektron nyalábot a kamera elől, hanem épp innen verődnek vissza az elektronok a detektorba. Az eredmény ugyanolyan kép lesz. Ezután a vákuumtérben egy gyémántkés lemetsz egy réteget a szövet blokk tetejéről (erre a metszetre már nem lesz szükség) és az így feltárult új felszínt a készülék újra pásztázza. Ez a ciklus tetszőleges számban ismétlődik.

Természetesen továbbra is mérlegelni kell majd, hogy milyen munkákhoz, melyik készülék a legalkalmasabb. A Block-Face Scanning EM nagy előnye lesz, hogy nagyobb területek rendkívül hosszú sorozatainak tökéletesen illeszkedő képeit készíti el úgy, hogy az idegi profilok nem torzulnak, mivel a kép nem a gyémántkés által maga előtt tolt és hártyára felvett metszetről, hanem mindig a még érintetlen blokk felszínéről készül. Kvantitatív munkához ideális. Hátránya viszont, hogy felbontása valamivel kisebb, és nem lehet 10 perc alatt gyorsan ránézni 5 féle mintánkra úgy, mint a TEM használatával. Így a két technológia egymást kiegészítve lesz igazán hatékony.

- Az elv igazán érthető, és régi EM-esek számára nem tűnik boszorkányságnak a minta előkészítése sem. A mikroszkóp és a szoftverek megismerése, kezelése azonban nem sajátítható el egykettőre. Kb. mennyi időbe kerül, amíg valaki megbízhatóan, más betanítására is alkalmas szinten tud vele dolgozni?

- Szerintem kezdünk hozzászokni, hogy munkánkhoz bonyolult készülékek és még bonyolultabb szoftverek használata szükséges. A Block-Face Scanning EM esetében ez fokozottan igaz. Szerencsére a minta előkészítése nagyon hasonló (bár nem ugyanaz) mint a TEM esetén. A SEM-re előkészített szövetblokkok azonban alkalmasak a TEM vizsgálatok számára is. Így könnyű lesz az eddigi munkafolyamatokba való beillesztés.

A pontos betanulási időt még nem tudom megjósolni, ugyanis nem az a kérdés, hogy mennyi ideig tart valakinek segítséggel eljutni egy blokktól a kép elkészítéséig, hanem az hogy mennyi idő után képes valaki magabiztosan, a rengeteg apróságra koncentrálva és az esetleges meghibásodásokra is felkészülve üzemeltetni egy ilyen készüléket. Az biztos, hogy az első felhasználóknak olyan kollégáknak kell lennie, akik már gyakorlottan metszenek gyémánt késsel Ultracut készüléken, gyakorlottak a klasszikus EM használatában, és mondjuk jól értik a konfokális lézer szkenning fluoreszcens mikroszkópok működését, ugyanis ezek a készségek jó felkészítést adnak a Block-Face Scanning EM működtetéséhez. Egyébként a technológiát még mi is tanuljuk, egy hónapja keressük az ideális paramétereket. Sok kérdés és gyakorlati paraméter még ismeretlen. A beállítások száma nagy, és mivel az egész technológia annyira új, a gyártó nem tud a mi céljainknak pont megfelelő paramétereket javasolni.

- Mindössze három év, és lesz egy új intézet, minden mikroszkópot költöztetni kell. A művelet se nem olcsó, se nem veszélytelen. Mindent összevetve, ki fogjuk tudni használni a még hátralevő időt annyira, hogy megérje a kétszeri beépítési-telepítési költséget?

- Semmi kétség, hogy igen, megéri. Sok a kérdés, minden időt ki kell használni, ez a legnagyobb érték. Nagyon remélem, hogy már az első három évben több csoportot segítenek hozzá az új mikroszkópok komoly felfedezésekhez.

- Mi az a kérdés, amelynek megválaszolásához épp egy ilyen EM a legcélravezetőbb?

- Az első és legfontosabb célunk most azt beállítani, hogy lehetőleg mindazokat a kérdéseket, melyeket eddig TEM készülék segítségével vizsgáltunk, most már a Block-Face Scanning EM segítségével tudjuk nézni, csak sokkal gyorsabban, és akár jóval nagyobb mintán.

Ehhez meg kell találnunk a megfelelő gyantát a legmegbízhatóbb metszéshez, a leghatékonyabb dehidrálási protokollt a minta vezetőképességének növeléséhez, és a legjobb felbontást adó pásztázási beállításokat is, amelyek még elkerülik a minta roncsolását.

Ennek beállítása máris óriási előrelépést jelent majd, hiszen nagyságrendekkel több képi adat áll majd rendelkezésre az EM-szintű alapvető megfigyelésekhez, a változások vizsgálatára vagy akár a keresett szinaptikus kontaktusok megtalálásához.

Ezután állhatunk neki a Block-Face Scanning EM igazi potenciáljának kihasználásához. A készülék ugyanis elvben akár órákig (vagy napokig) is tud önállóan metszeni és fényképezni. Az ilyen mennyiségű adat esetén azonban már a nyers adatok megfelelő hatékonyságú kinyerése válik kulcsfontosságúvá. Szerencsére sok laboratórium fejleszt hozzáférhető, részben automatizált eszközöket a szövetblokkok EM struktúráinak hatékony szegmentálására.

Az így nyerhető adatok mennyisége akár olyan változások kimutatására is alkalmas, melyeket eddig a limitált elemszám miatt nem is remélhettünk. Genetikai elváltozások, humán betegségek vizsgálata vagy akár gyógyszerhatások is vizsgálhatók lesznek, pl. a szinaptikus struktúrák vagy a tüsketérfogatok változásának tanulmányozásával. Jó példa erre Luisa de Vivo és társainak munkája a most februári Science-ben, amiben főleg Block-Face Scanning EM adatokra támaszkodva vizsgálták a szinaptikus változásokat alvás/ébrenlét során.

- És mi lesz a TE első munkád ezzel a mikroszkóppal?

- Mint mondtam, igyekszünk elsősorban az eddigi munkát gyorsítani. Ugyanakkor a Block-Face SEM igazi képességeit egy, a Human Brain Project keretében folyó vizsgálatsorozatban teszteljük elsőként, ahol célunk emberi és egér interneuronok és fősejtek különböző típusainak vizsgálata, nyúlványaik térfogati, felszíni paramétereinek, tüskéik térfogatainak elemzése egészséges és Alzheimer-kóros mintákon. Mindez elengedhetetlen a Human Brain Projectben folyó pontos neuronális és hálózati modellek megalkotásához.