Kihallgatni az idegsejtek suttogását: sokelektródás elvezetések

Az elvezetett elektromos jelek eltérő frekvenciájú (sebességű) alkotóelemekből állnak, melyeket megfelelő módszerekkel (digitális vagy elektromos szűrőkkel) el lehet választani egymástól. Szemléltetésként képzeljük el a Dunát, amin egy hajó elhaladásakor lassú nagy hullámok alakulnak ki és terjednek, de ha egy csuka a kis halak közé csap akkor a nagy hullámok felszínén apró pici fodrok jelzik a menekülő kis halakat. Egy vidra vagy egy fóka a bajusszálaival képes ezeknek a víz alatt is terjedő, eltérő hullámhosszúságok hullámoknak az érzékelésére. Mint ahogy ők is képesek elkülöníteni a halak által keltett gyors rezgéseket a víz hullámzása vagy áramlása miatt keletkező lassú ingadozásoktól, az elektrofiziológusok is képesek arra, hogy elemeire bontsák az elektromos jeleket. Ez azért fontos, mert a lassú összetevők sok sejt átlag aktivitásáról adnak információt, a gyors komponensek pedig a működő sejtek által kibocsájtott akciós potenciálokról, azaz az éppen működő sejtekről árulnak el dolgokat.

Az egyedi sejtek működésének elcsípésére szolgáló módszert (elektróda, szűrés és elemzés) nevezik unit (egység) elvezetésnek.

Ez idáig egyszerűen hangzik, de az elektrofiziológusok egyszerre minél több idegsejt működését szeretnék azonosítani, hiszen az agyi információt az idegsejtek működésének mintázata hordozza.

A feladatot ahhoz hasonlíthatjuk, mint amikor egy réten, este a sötétben mikrofonokkal felvett hangfelvételek alapján szeretnénk kitalálni, hogy hány birka béget bánatosan a sötétben. A mikrofon ugye csak azt érzékeli, hogy milyen erős hangot vesz fel, illetve mikor, de azt nem tudja merről jön a hang. Elektródáink is így működnek, csak a jel erősségét, az elektródán eső feszültséget képesek mérni, időben pontosan, de azt nem tudják merre van a jelet kibocsájtó sejt. Ha egy mikrofonunk van akkor csak azt tudhatjuk, hogy több birka van, hiszen eltérő erősségű bégetések érkeznek. Az is előfordulhat, hogy több birka ugyanolyan távolságra van és hangjuk ugyanolyan erősen érkezik. Ezt a problémát úgy lehet megoldani, hogy a réten, egymástól távol még egy, vagy eltérő helyeken, még több mikrofont helyezünk el. Így bár az egyik mikrofonon két birka ugyanolyan hangosnak hallatszhat, egy másik mikrofontól eltérő távolságban lesznek és hangjuk erőssége el fog térni.

Azaz, ha egy adott pillanatban érkező bégetések erősségének az arányát megvizsgáljuk, akkor az birkákként egyedi lesz. Jól elhelyezett mikrofonokkal, ha birkák egymástól megfelelő távolságra helyezkednek el, egy réten több tucat birkát tudunk azonosítani. Sőt, ha feltételezzük, hogy a bégetés erőssége arányos a birka távolságával az adott mikrofontól, akkor még a helyzetét is meg tudjuk határozni a mezőn (háromszögeléses módszer). Az elektrofiziológusok pontosan ezt csinálják az agyban is. Olyan sokcsatornás elektródokat használnak, melyek kivezetései egymástól néhány tucat mikronra helyezkednek el és így számos sejt azonosítható (multi-unit, sok-unit elvezetés).

És persze az élőlények is használják ezt a trükköt, hiszen azért van két fülünk, hogy a hang térbeli helyzetét meg tudjuk határozni. Sőt, ha valaki közelebbről megnézi egy macska, egy ember vagy még inkább a denevér fülét, láthatja, hogy azon mindenféle ravasz redők találhatók. Ezek szerepe, hogy még jobban szétválasztják az eltérő irányokból érkező hangokat, mintha nem kettő, hanem négy, hat, vagy nyolc fülünk (mikrofonunk lenne).

Az első ilyen több sejt azonosítására alkalmas elektródát tetródnak nevezték el, mert 4 (görögül tetra) elektród szálat ragasztottak egymás mellé. Sokan még ma is kézzel készítik a 4 darab 10 mikrométeres szigetelt wolfram szálból összesodort apró elektródákat. Ez kézügyességet és nagy türelmet igényel. Fontos az elektród hegyének kialakítása is, mivel minél kisebb annak ellenállása annál erősebben veszi a jeleket. Ezért az elektródakészítéshez az is hozzátartozik, hogy elektromos árammal ellenállást csökkentő aranyréteget választanak ki az elektródák hegyére megfelelő oldatokból. Ugye amikor erősen fülelünk, akkor levesszük a sapkát meg a kapucnit, hogy kisebb legyen a hanghullámok számára az ellenállás.
A sejt és soksejt (unit és multi-unit) elvezetések nagy nehézsége, hogy az elektródák csak körülbelül 50 mikrométer távolságig hallják a sejteket, azaz nagyon pontosan kell őket beállítani. Az agy egy puding állagú szerv, mely egy kemény csontos tokba a koponyába van bezárva. Elektródáinkat valamihez rögzíteni kell, hogy ne mozduljanak el a sejtekhez képest. Erre két módszert használnak. Vagy az állat fejét rögzítik egy kerethez, melyhez az elektróda kapcsolódik, vagy fogászati cement segítségéve egy kis „koronát” építenek a koponyacsontra (altatás alatt) és ehhez rögzítik az elektródákat. Az első esethez altatott állatot használnak és az elvezetés csak néhány óráig tarthat. A fejre épített elektróda tartót (drive) viselő állatból már napokig, jól sikerült, tiszta, pontos műtét esetén hetekig lehet ugyanazon sejtek aktivitását megfigyelni, miközben az állat szabadon mozog. De egy-egy ilyen műtéthez pontos kéz és nagy rutin szükséges, különben az agyszövetet ért károsodások miatt az megduzzad, elmozdul és a nehezen megszerzett sejtek eltűnnek.

Hogy az azonosított sejtek számát növelhessék, a kutatók tetrode kötegeket készítenek, melyekben az egyedi tetródok helyzete az agyon belül a koronára helyezett drive-ban finom csavarokkal állítható és úgy mozgathatók, hogy a sejtekről a legerősebb jeleket lehessen elvezetni. A tetródok nagy előnye, hogy a vékony finom elektródák rugalmasak és együtt mozognak az aggyal, a sejtek elvezetése stabilabb. A tetródok elkészítése bolhapatkolás, sok munkát igényel, cserébe viszonylag olcsók. Sajnos aránylag nagy roncsolást végeznek a szövetben, hiszen egy köteg 100 mikrométer vastag is lehet, illetve rugalmasságuk miatt mélyebben eső agyterületek célbavétele nehéz, mert miközben az agyba hatolnak elhajolhatnak és elkerülik a célterületet.

Az elektródák számának növelésére, a roncsolás csökkentésére és a pontosabb célzásra fejlesztették ki a „silicon probe”-okat, melyeket, mint nevük is sugallja szilikonból készítenek a computer chipek technológiájával. Itt egy 15 mikron vastag és 50 mikron széles alapra építik fel az elektródákat fotolitográfiával. Ennek finom felbontása miatt egy ilyen probe-ra (szondára) 70-150 elektróda is elhelyezhető. A fejlett technológiának persze ára van, egy ilyen elektróda 5-800 dollárba kerül. Katalógusból lehet megrendelni milyen kiosztású elektródasor felel meg igényeinknek, de egyedi elektródákat is tervezhetünk, persze ennek ára jelentősen borsosabb.

A továbbfejlesztett probe-oknak már több ága is lehet egymástól 150 mikrométerre, áganként 128 csatornával és vezető műanyag bevonattal, amely jelentősen csökkenti az elektródák ellenállását és ezáltal javítja az elvezetett jel minőségét, ami több sejt azonosítását teszi lehetővé. Ezek a kütyük már akár 2000 dollárba is belekerülhetnek.

Figyelemre méltó újdonság a Neuropixelnek nevezett szondák kifejlesztése. Ezeken már áganként 1024 csatorna található, melyek közül a probe-ba épített logikai áramkörök segítségével választhatjuk ki melyekről szeretnénk jeleket felvenni. Ezekkel az elektródokkal még az is megoldható, hogy amikor az agyszövet elmozdul és az egyes sejtek jele szomszédos elektródákra vándorol, akkor megfelelő programozással megtartsuk a sejteket akár több napon keresztül is. Ezekben a fejlett szondákban már az elektródák közelében vannak elhelyezve a jel előerősítők, így sokkal zajmentesebb és ezért több sejt aktivitásának elkülönítésére alkalmas méréseket végezhetünk szabadon mozgó állatokban.
A legújabb technológia pedig a szövetbe juttatás után feloldódó hordozójú elektródákat használ, melyek jelét vezetőképes műanyagok továbbítják. Ezekkel a szabadon lebegő elektródákkal, melyek követik az agy mozgását, alakulását, azt a bravúrt hajtotta nemrégiben végre egy amerikai kutatócsoport, hogy egy kölyökegérbe ültetett elektróda hálóval a felnövekvő egérben követték egy éven keresztül az idegsejtek működésének alakulását.

A sokcsatornás elektródokat nemcsak sejtek azonosítására, hanem elektro-anatómiára is fel lehet használni. Ha egy szondán szabályos távolságra helyezünk el elektródákat akkor meg tudjuk mérni, hogy az egyes agyi rétegekben milyen EEG jel figyelhető meg. A csatornák közötti különbségek elemzésével pedig (CSD analízis) megérthetjük, hogy a különböző rétegekben elhelyezkedő sejtnyúlványokon milyen ionáramok folynak és ezek hogyan befolyásolják a jelfeldolgozást.

Az optogenetika megjelenésével új lehetőség és igény jelent meg a mikroelektródákat hordozó szondákkal szemben. A fény hatására sejtek serkentését vagy gátlását kiváltó opszinok tében és időben pontos bekapcsolására a szondákba a mikroelektródák és előerősítők mellé fénykibocsájtó lézerdiódákat is beépítenek a gyártás során. Így a szondák nem csak mérni, hanem befolyásolni is képesek a sejtek működését. Ez a kombináció új lehetőségeket adott annak meghatározására, hogy az egyes azonosított sejtek melyik agyterületre vetítenek. Az opto-tagging (fény-címkézés) eljárás lényege, hogy egy távoli agyterületre beadott vírus segítségével opszinokkal jelölődnek az oda vetítő sejtek. Ha ezek után fénnyel aktiváljuk őket, miközben mérünk, a megfigyelt jelalakok alapján meghatározhatjuk, hogy tüzelő sejtjeink közül melyek vetítenek a vizsgált célterületre és tüzelési mintázatuk miben tér el a többi megfigyelt sejtétől.

Ez idáig a technológiai lehetőségek felsorolása volt. De ezeket árnyalja a kétkezi valóság. A sejt és soksejt (unit és multi-unit) elvezetések nagy nehézsége, hogy az elektródák csak körülbelül 50 mikrométer távolságig hallják a sejteket, azaz nagyon pontosan kell őket beállítani. Az agy egy puding állagú szerv, mely egy kemény csontos tokba a koponyába van bezárva. Elektródáinkat valamihez rögzíteni kell, hogy ne mozduljanak el a sejtekhez képest. Erre két módszert használnak. Vagy az állat fejét rögzítik egy kerethez, melyhez az elektróda kapcsolódik, vagy fogászati cement segítségéve egy kis „koronát” építenek a koponyacsontra (altatás alatt) és ehhez rögzítik az elektródákat. Az első esethez altatott állatot használnak és az elvezetés csak néhány óráig tarthat. A fejre épített elektróda tartót (drive) viselő állatból már napokig, jól sikerült, tiszta, pontos műtét esetén hetekig lehet ugyanazon sejtek aktivitását megfigyelni, miközben az állat szabadon mozog. De egy-egy ilyen műtéthez pontos kéz és nagy rutin szükséges. Egyrészt, ezek az 1-4000 dolláros szondák hajszálnál vékonyabb, rideg és törékeny szilikonból készülnek!! Képzeljétek el milyen stresszes lehet egy ilyen drága tojáshéjjal dolgozni. Másrészt a koponyát és az agyhártyákat nagyon finoman kell megnyitni, különben az agyszövetet ért károsodások miatt az később megduzzad, elmozdul és a nehezen megszerzett sejtek eltűnnek.
Egy 5-8 órás szerelés-operáció alatt az elektróda sorokat hordozó szondákat (probe) rá kell szerelni a mozgatásukra szolgáló szerkezetre (drive), majd ezt a koponyához kell fogászati cementtel rögzíteni. Ezután be kell kötni az elektromos csatlakozókat, majd a méréseket zavaró elektromágneses zajok leárnyékolására egy rézhálóból készített apró Faraday kalitkát kell az egész köré építeni. Mindennek persze kicsinek kell lenni, hiszen az apró egér a fején viseli. Aki ügyes az egy probe-ot 4-6 állat egymás utáni mérésére is fel tudott használni, de minden mérés után hasonló precíz és idegőrlő szereléssel kellett a szondát leszerelni az állat fejéről (előtte leszedni a Farady kalitkát, a drive-ot).

A 3D nyomtatók megjelenése sokat segített. Manapság moduláris rendszerben nyomtatják műanyagból, illetve még jobb megoldásként fémből a szondát (probe) ot tartó pozícionálót (drive), az ezt tartó koronát és az azt fedő Faraday kalitkát. Külön nyomtatott adapter segítségével helyezhető be és távolítható el az érzékeny szonda. Így elérhető az, hogy ne kelljen minden alkalommal fogászati cementtel összeépíteni az elemeket és ki-be szerelés közben elkerülhető a kisebb vagyont érő szondák összetörése.

A sokcsatornás elvezetések méréstechnikai részét ezzel le is zárjuk. A következő #agytechnikák bejegyzésben a felvett jelek elemzésének trükkjeiről lesz szó.

Szerző: Gulyás Attila

(A cikk megírásához nyújtott segítségéért köszönet illeti Varga Viktor kollegámat)