A doppingolt igásló: a fluoreszcens festések és mikroszkópok

2022. október 11, kedd

Az előzőbejegyzésben bemutaott technikák jellemezték a neuroanatómiát az 1980-2000es években. Jelentős továbblépést a jóminőségű, elérhető fluoreszcens mikroszkópok megjelenése és az ezzel járó fluoreszcens festék fejlesztés jelentette.
Mi is az a fluoreszcens festék és miért fontos? A fluoreszcenciajelensége nevét a fluorit ásványról kapta, melyet az emberi szem számára nem látható (bár azt károsító) UV (ultraibolya) fénnyel megvilágítva az kékes-lilán világít, azaz a spektrum (szivárvány, színskála) egy általunk nem látott tartományában ráeső fényt elnyelve egy általunk látható fényt bocsájt ki. A fluoreszcencia során, tehát egy megfelelő hullámhoszúságú fénnyel megvilágított molekula azt elnyeli, majd gyakorlatilag azonnal egy alacsonyabb, jól meghatározott hullámhosszúságú fényt bocsájt ki. Amikor a fénykibocsájtás nem azonnali, hanem elnyújtott akkor beszélünk foszforeszcenciáról.

No de mi az a spektrum? Hát a szívárvány színei és azon túl. Mint azt James Clark Maxwell felismerte a fény elektronmágneses sugárzás. Az elektronmágneses sugárzásnak sok fajtája van. Mindegyik fajtáját jellemzi, hogy mekkora energiát hordoznak az őt közvetítő részecskék a fotonok. Ez meghatározza azt is, hogy az adott elektromágneses sugárzásnak mekkora a hullámhossza. Minél nagyobb az energia, annál rövidebb a hullámhossz. A rádióhullámok hordozzák a legkisebb energiájú fotonokat, ezért ezek hullámhossza a legnagyobb: a kilométertől a milliméterig terjed. A legenergikusabb rádióhullámok a mikrohullámok után a távoli infravörös és infravörös sugárzás következik µm-es hullámhosszal. Ezután következik a látható fény hullámhossza, mely a 800 nmes (nanométer a méter egy milliárdod része) vörös fénytől a 400nmes ibolyáig terjed. Ezen TÚL van az ibolyán-túli sugárzás az UV, melynek hullámhossza 400nm alatt van és azért károsíthatja szemünket, bőrünket, mert sok energiát hordoz. A legkeményebb UV után a Röntgen sugárzás, majd a gamma és a kozmikus sugárzások következnek. Ezek már olyan energikusak, hogy ionizáló sugárzásoknak hívjuk őket és tartani kell tőlük, mert DNS károsodást és ezért sejthalált, illetve rákot okozó mutációkat keltenek.
Visszatérve, mi itt most a látható fénytartománnyal, illetve a közeli UV és közeli infravörös (IR) tartománnyal fogunk dolgozni.


De miért fontos a fluoreszcencia jelensége számunkra? Számos okból. A legfontosabb, hogy a klasszikus fénymikroszkópiában a mintánkat elárasztjuk fénnyel melyet a festékek elnyelnek, árnyékot vetnek. Mivel az optikai rendszer sosem tökéletes, mert a lencserendszer, de még inkább a biológiai minta jelentősen szórja a fényt, a fénymikroszkópban keletkező szórt fény igen lerontja a képminőséget, és ezáltal csökkenti a festés érzékenységét, valamint kontrasztját. Amennyiben az antitest-szendvicsre a fényelnyelő festékek és ilyen festékeket termelő enzimek helyett fluoreszcens festéket kötünk, abból számos előnyünk származik.
 


De hogy ezt kiaknázhassuk speciális mikroszkópra, fluoreszcens mikroszkópra van szükségünk. A fluoreszcens mikroszkóp egy nagyon keskeny hullámhossztartományba szorított gerjesztőfényt használ a megvilágításra, melyet megfelelő szűrőket használva megakadályoz abban, hogy a megfigyelő szemébe vagy manapság ennél sokkal érzékenyebb CCD kamerákba jusson. Ezt a gerjesztő fényt a megfelelő helyre horgonyzott fluoreszcens molekulák elnyelik és alacsonyabb hullámhosszon (más színben) kibocsájtják. A mikroszkóp a megfigyelő irányába csak a molekulák által kibocsájtott fényt engedi át, így a sötét háttér előtt erősen világít, amit keresünk. Gondoljuk végig mit könnyebb észrevenni, a napos égen magasan repülő madarat, vagy egy a sötét erdőben egy ugyanolyan távol világító lámpát? Ily módon a szórt gerjesztő fény zavaró hatása eltűnik.