A doppingolt igásló: a fluoreszcens festések és mikroszkópok

2022. október 11. kedd

Az előzőbejegyzésben bemutaott technikák jellemezték a neuroanatómiát az 1980-2000es években. Jelentős továbblépést a jóminőségű, elérhető fluoreszcens mikroszkópok megjelenése és az ezzel járó fluoreszcens festék fejlesztés jelentette.
Mi is az a fluoreszcens festék és miért fontos? A fluoreszcenciajelensége nevét a fluorit ásványról kapta, melyet az emberi szem számára nem látható (bár azt károsító) UV (ultraibolya) fénnyel megvilágítva az kékes-lilán világít, azaz a spektrum (szivárvány, színskála) egy általunk nem látott tartományában ráeső fényt elnyelve egy általunk látható fényt bocsájt ki. A fluoreszcencia során, tehát egy megfelelő hullámhoszúságú fénnyel megvilágított molekula azt elnyeli, majd gyakorlatilag azonnal egy alacsonyabb, jól meghatározott hullámhosszúságú fényt bocsájt ki. Amikor a fénykibocsájtás nem azonnali, hanem elnyújtott akkor beszélünk foszforeszcenciáról.

No de mi az a spektrum? Hát a szívárvány színei és azon túl. Mint azt James Clark Maxwell felismerte a fény elektronmágneses sugárzás. Az elektronmágneses sugárzásnak sok fajtája van. Mindegyik fajtáját jellemzi, hogy mekkora energiát hordoznak az őt közvetítő részecskék a fotonok. Ez meghatározza azt is, hogy az adott elektromágneses sugárzásnak mekkora a hullámhossza. Minél nagyobb az energia, annál rövidebb a hullámhossz. A rádióhullámok hordozzák a legkisebb energiájú fotonokat, ezért ezek hullámhossza a legnagyobb: a kilométertől a milliméterig terjed. A legenergikusabb rádióhullámok a mikrohullámok után a távoli infravörös és infravörös sugárzás következik µm-es hullámhosszal. Ezután következik a látható fény hullámhossza, mely a 800 nmes (nanométer a méter egy milliárdod része) vörös fénytől a 400nmes ibolyáig terjed. Ezen TÚL van az ibolyán-túli sugárzás az UV, melynek hullámhossza 400nm alatt van és azért károsíthatja szemünket, bőrünket, mert sok energiát hordoz. A legkeményebb UV után a Röntgen sugárzás, majd a gamma és a kozmikus sugárzások következnek. Ezek már olyan energikusak, hogy ionizáló sugárzásoknak hívjuk őket és tartani kell tőlük, mert DNS károsodást és ezért sejthalált, illetve rákot okozó mutációkat keltenek.
Visszatérve, mi itt most a látható fénytartománnyal, illetve a közeli UV és közeli infravörös (IR) tartománnyal fogunk dolgozni.


De miért fontos a fluoreszcencia jelensége számunkra? Számos okból. A legfontosabb, hogy a klasszikus fénymikroszkópiában a mintánkat elárasztjuk fénnyel melyet a festékek elnyelnek, árnyékot vetnek. Mivel az optikai rendszer sosem tökéletes, mert a lencserendszer, de még inkább a biológiai minta jelentősen szórja a fényt, a fénymikroszkópban keletkező szórt fény igen lerontja a képminőséget, és ezáltal csökkenti a festés érzékenységét, valamint kontrasztját. Amennyiben az antitest-szendvicsre a fényelnyelő festékek és ilyen festékeket termelő enzimek helyett fluoreszcens festéket kötünk, abból számos előnyünk származik.
 


De hogy ezt kiaknázhassuk speciális mikroszkópra, fluoreszcens mikroszkópra van szükségünk. A fluoreszcens mikroszkóp egy nagyon keskeny hullámhossztartományba szorított gerjesztőfényt használ a megvilágításra, melyet megfelelő szűrőket használva megakadályoz abban, hogy a megfigyelő szemébe vagy manapság ennél sokkal érzékenyebb CCD kamerákba jusson. Ezt a gerjesztő fényt a megfelelő helyre horgonyzott fluoreszcens molekulák elnyelik és alacsonyabb hullámhosszon (más színben) kibocsájtják. A mikroszkóp a megfigyelő irányába csak a molekulák által kibocsájtott fényt engedi át, így a sötét háttér előtt erősen világít, amit keresünk. Gondoljuk végig mit könnyebb észrevenni, a napos égen magasan repülő madarat, vagy egy a sötét erdőben egy ugyanolyan távol világító lámpát? Ily módon a szórt gerjesztő fény zavaró hatása eltűnik.

 

 

Eddig tehát, fluoreszcens festéket használva jelentősen növeltük az érzékenységet és képminőséget. A következő nagy lépést az teszi lehetővé, hogy a vegyészeknek a fluoreszcens festékek hatalmas repertoárját sikerült előállítaniuk. A gerjesztő és kibocsájtott fény spektrumát széles határok között lehet tologatni, azaz elérhető, hogy számos nem átfedő színű fényt kibocsájtó molekulát használjunk egyszerre.

 

Míg a klasszikus immuncitokémiával egyszerre maximum két anyag előfordulását lehetett vizsgálni, addig immunfluoreszcens festésekkel rutinszerű 4 vagy esetleg több anyag eloszlásának vizsgálata. Ez meghatványozza a kapcsolatrendszerek felderítésének lehetőségét és a sejtek működésében fontos molekulák térbeli azonosítását. Például az egyik festék megjeleníti az idegsejtek magját, két másik egy-egy sejtcsoportot, egy harmadik festékkel pedig a sejtek közötti szinapszisokban található anyagokat megjelölve meg tudjuk mutatni, hogy a két sejt alkot-e kapcsolatot egymással.

 

A fluoreszcens mikroszkópok használatában a következő lépésére akkor került sor, amikor a molekuláris biológusok medúzákból izolált fluoreszkáló fehérje géneket kezdtek el egerekbe építeni. Ily módon elérhető, hogy különböző sejtcsoportok más színű fehérjéket fejezzenek ki és így már immunfestésre sincs szükség ahhoz, hogy sejttípusokat és azok kapcsolódási rendszerét azonosítsuk. Az is megoldható, hogy a sejtek csak akkor világítsanak, ha bizonyos gének bekapcsolnak. Ezzel az embrionális fejlődés lépései is tanulmányozhatók. Nem csoda, hogy a GFP (green fluoreszcent protein, azaz zölden fluoreszkáló fehérje) felfedezéséért és az ezen alapuló mérési módszerek kidolgozásáért Osamu Shimomura, Martin Chalfie és Roger Y. Tsien munkásságát 2008-ban kémiai Nobel díjjal jutalmazták. Ha például 3 elérő színű fehérjét véletlen mennyiségben fejeznek ki a sejtek, akkor minden egyes sejt a szivárvány más színében világít. Ez adja a BRAINBOW (agyszivárvány) technika csodálatos képeit.

 



És mikroszkópból van még jópár féle! Te mire használnál amit itt tanultál?

Mikroszkópok

Az agykutatásban használt néhány mikroszkóp az intézet "fegyvertárából"

Egy igásló, mindennapi használatra, a minták gyors vizsgálatára és fényképezésére. Egy anatómiai labor elengedhetetlen alapeszköze. Speciálisabb feladatokra a bonyolultabb mikroszkópokat használjuk.
Az egyik legegyszerűbb átvilágító és fluoreszcens mikroszkópunk
Zöld gerjesztő fénnyek vizsgált minta fluoreszcens mikroszkópban
Fluoreszcens mikroszkóp képeinek feldolgozása
Élő agyszelet vizsgálatára alkalmas fény és fluoreszcens mikroszkóp
Képes több anayag elhelyezkedésének egyidejű 3D vizsgálatára
Konfokális mikroszkóp 6 gerjesztő lézerrel és nagysebességű (rezonáns) pásztázással
Élő sejtek vizsgálatára is felszerelt szuperrezolúciós (STORM) mikroszkóp
Az agyról készült sorozatmetszeteket fényképezi le automatikusan
Tárgylemez scanner
Transzmissziós elektronmikroszkóp
70 nanométeres metszeteken vizsgálhatók vele a szinapszisok és egyéb finom agyi struktúrák 20-100 ezres nagyításban
Transzmissziós elektronmikroszkóp (T-EM)
A vizsgálóablakban látható kép. Ezt manapság már csak keresésre használjuk, a képeket érzékeny CCD kamerák rögzítik.
Transzmissziós elektron mikroszkóp képe
Az EM képek számítógépes feldolgozása
Igen finom felbontású 3D képeket lehet vele készíteni az idegsejtekben található molekulák eloszlásáról
Elektron tomográfiára alkalmas EM
Korábbi hozzászólások
Még nincsenek hozzászólások
Új hozzászólás
A hozzászólások moderáltak, csak az Admin jóváhagyása után jelennek meg!