Hogyan használják a neuroanatómusok igáslovukat, a fénymikroszkópot?

2022. október 7. péntek

A mikroszkópok palettáját már röviden bemutattuk, most kicsit alaposabban vesszük végig melyik mire is való és hogyan kell megfesten a mintákat használatukhoz.

A klasszikus fénymikroszkóp az anatómus laborok igáslova. Minden laborban van több is. Hiszen az anatómusi munka számos fázisában szükséges, hogy alaposabban megnézzük azt a pici dolgot, amivel dolgozunk. Ahhoz, hogy az agyszövetet festeni és vizsgálni lehessen szükséges abból 30-150 µm (mikrométer, a méter egymilliomod része) vastagságú (ez inkább vékony) metszeteket készíteni. Egyrészt, hogy a festéshez használt anyagok be tudjanak diffundálni a metszet teljes mélységébe, másrészt, hogy a fény jelentősebb szóródás nélkül áthatoljon a metszeten és a mikroszkópban éles képet kapjunk.

Ezeket az apró törékeny szövetdarabokat a feldolgozási fázis alatt többször is meg kell vizsgálni, hogyan zajlanak a reakciók. Erre használjuk az általában 10x-100x-os tárgylencsével és 10x-es szemlencsével felszerelt egyszerű fénymikroszkópokat, melyek nagyítása így 100-1000x-es. Ezeken a nagyításokon agyi területek, bennük a sejtek, valamint axon- és dendritnyúlvány rendszerük azonosítható. Az „egyszerű fénymikroszkóp” kifejezés azért túlzás. A kutatók nem az iskolák által megfizethető minőségű mikroszkópokat használnak, hanem jelentősen drágább lencserendszerű, komoly gépeket. De ez kell is, mert ha valaki napi 4-6 órát ül a mikroszkóp előtt akkor nagyon hamar fejfájást kap, ha annak képe nem tökéletes. Egy iskolai és egy kutatómikroszkóp között kb. akkora a különbség minőségben és árban is, mint egy Trabant és a legújabb merdzsó között. Az egyszerűtől (balra)az összetetteb (fény és fluoreszcens vizsgálatra is alkalmas, digitális képfeldolgozó rendszerrel felszerelt, jobbra) mikroszkópok ára 3 és 30 millió forint között mozog.


De milyen festéseket is vizsgálunk fénymikroszkóppal és mire jók ezek? Az egyik alap festés a Nissl festés, melynek során megfelelő sorrendben, kémiailag előállított festékekben mossuk a metszeteket. Ennek során az idegsejtek sejtteste és vastagabb dendritágai kék színnel megjelölődnek. Ezzel a festéssel csak annyit tud meg az ember, hogy hogyan csoportosulnak a sejtek, azaz segít az agyterületek megtalálásában.
 
Mondjuk ez a „csak” is komoly lépésekhez vezetett az agykutatás korai fázisában. Ennek alapján térképezték fel az Öregek az agyat. Korbinian Brodman német anatómus észrevette, hogy az agykéreg eltérő területei jellegzetes, szinte vonalkód szerű, sejteloszlás mintázatot mutatnak. Ennek alapján az emberi agyat 52 cytoarchitektonikai (sejtépítészeti) területekre osztotta. Ezekről a területekről később kiderült, hogy mindegyik más agyi feladat megoldását végzi.

 

A klasszikus kémiai festések repertoárját nem érdemes tovább listázni, mert az immunfestés és a transzgénikus sejtjelölések teljesen kiszorították használatukat. Nézzük meg mi is az az immunfestés (immuncytokémiának vagy immunhisztokémiának is mondják). Ugye a klasszikus festékek kémiai-fizikai kölcsönhatással tapadtak bizonyos sejtekhez vagy sejtalkotórészekhez. Nem sok lehetőség volt a célzás megváltoztatására és újabb festések kifejlesztése próba-szerencse alapon ment. Ezzel szemben az immunfestéssel majdnem tetszőleges sejtalkotó molekulák megcélozhatók. Azaz, ha van egy sejttípusra jellemző fehérjém, vagy egy sejtalkotó részhez kötődő másik fehérjém akkor, ha ezekre célzok sejttípusokat, vagy sejtalkotó részeket tudok azonosítani. Hogy is történik ez. Mondjuk egy egérben található fehérje ellen szeretnék ellenanyagot készíteni. Először is tiszta formában elő kell állítani ezt az anyagot, majd ezt bejuttatni egy másik állatfaj szervezetébe. A fehérjét ez a faj idegenként ismeri fel, fertőző betolakodónak véli és immunsejtjei ellenanyagot kezdenek termelni ellene. Egérbe ugye nem adhatom be, mert egy faj saját fehérjéi ellen nem termel ellenanyagot normál esetben, ha igen nagy baj van, autoimmun betegségnek hívják. Leggyakrabban nyulakat, tengerimalacokat, lovakat, szamarakat használtak erre a célra. De manapság már hatékonysági és állatvédelmi okokból is sok ellenanyagot immunsejtek tenyészetében állítanak elő. Az elkészült ellenanyag azonban, ha hozzákötődik az agyszelethez még nem látszik, hiszen nem nyel el semmilyen színű fényt. A legegyszerűbb esetben a keletkezett ellenanyag molekulához lehetne festékanyagot kötni, hogy látható legyen. De ezt két okból sem használják. Egyrészt így viszonylag kevés festékanyag utazna az antitesttel a szövetbe és a festés nem lenne elég érzékeny. Másrészt minden ellenanyagot meg kellene jelölni festékkel és így árulni a „boltban”. Ez nem egy gazdaságos logisztikai megoldás. Ezért fejlesztették ki az indirekt (közvetett) immunfestést.

 

  Itt azt a jelenséget használják ki, hogy ha az A fajból származó antitestet beadom B fajnak akkor a B faj ellenanyagot termel az A faj ellenanyaga ellen. Ezek után ha ezt az antitestet B-anti-A megjelölöm festékkel és az immunfestés során egy második lépcsőben használom két legyet ütök egy csapásra. Egyrészt miután az első, mondjuk nyúlból származó antitest (primer antibody), akár több példány is, hozzákötődik a célfehérjéhez, a második lépcsőben kecskében nyúl ellen termeltetett antitestet köthetek a nyúl elsődleges antitesthez. Ha ezt a kecske-anti-nyúl fehérjét megjelölöm festékkel, akkor egyrészt mivel ebből is több kötődhet az elsődleges antitesthez jelentős jelerősítést érek el. Másrészt a „boltban” elég egyfajta festékkel jelölt antitestet árulni minden faj antiteste ellen.
De a dolgok itt nem álltak meg. Ahhoz, hogy az immunfestés érzékenységét tovább fokozzák két trükköt dobtak be a kutatók. Egyrészt megfelelő trükköket használva egy harmadik antitest réteget is bele lehet dobni a szendvicsbe ezzel tovább növelve az egy célfehérjére tapadó molekulák számát. Másrészt az ellenanyaghoz nem egy festékmolekulát, hanem egy színes molekulák képződését katalizáló fehérje enzimet kötnek. Így minden egyes harmadik rétegi antitest többezer festékmolekulát horgonyoz le a szövetben a kellő helyen, szép erős kontrasztú jelet eredményezve.


Mit is láthatunk ily módon? Ha egy fehérjemolekula mondjuk egy sejttípus minden elemében megtalálható akkor a 3 réteg antitest és az enzimreakció után a fénymikroszkópban láthatjuk ezen sejtek teljes nyúlványrendszerét. Kis nagyításon (100-400x) láthatjuk merre futnak a sejtek dendritjei és axonjai. Azaz az adott sejttípusok milyen területen gyűjtik a bemenetüket és hova küldik jeleiket. Ezzel ugye megtehetjük a hálózatkutatás első lépéseit: milyen elemeink vannak, ezekből mennyi van. Nagyobb nagyításon (1000x) már azonosíthatjuk az axonon a terminálisokat és megszámolhatjuk a sejttípus mennyi kapcsolatot létesít saját magával.


De az immunfestést tovább is lehet bonyolítani. Amennyiben két eltérő fajból származó ellenanyaggal két célanyagot jelenítünk meg két eltérő sejtcsoportban, majd a megfelelő (meglehetősen bonyolult szabályoknak eleget tevő) antitest szendvicset építjük fel és a dolog végén két eltérő színű festéket gyártunk a kötött enzimekkel, akkor párhozamosan egyszerre két sejtcsoport nyúlványrendszerét vizsgálhatjuk. Itt a 2x annyi több lesz, mint 2x. Ugyanis így megnézhetjük azt is, hogy az egyik színnel jelölt sejt nyúlványai létesítenek-e kapcsolatot a másik színnel jelölt sejteken (lásd ába, ahol egy távoli agyterületről érkező fekete axonok kapcsolatokat létesítenek a barnával jelölt célsejteken). Tovább léphetünk a megismerés létráján, mert a korábban azonosított elemek között megállapíthatjuk a kapcsolatok lehetséges irányát és ezek mennyiségét is. Máris viszonylag jól állunk egy hálózat kapcsolatrendszerének megértésében, és idáig még csak fénymikroszkópot használtunk.

Korábbi hozzászólások
Még nincsenek hozzászólások
Új hozzászólás
A hozzászólások moderáltak, csak az Admin jóváhagyása után jelennek meg!