Módszerek

Önmagában a TSH és a keringő PMH szintek alapján a szövet-specifikus PMH háztartás számos esetben nem ismerhető meg, utóbbi jellemzése komoly kihívást jelent  Ezért Intézetunk Integratív Neuroendokrinológia kutatócsoportjával és Orvosi Genetikai Részlegével együttműködve létrehoztuk és szabadalmaztattuk a THAI (Thyroid Hormone Action Indicator) egérmodellt (European Patent Office EP3223606; Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala HU230964; United States Patent and Trademark Office 10,694,724 B2). Az egérmodell minden sejtje egy PMH érzékeny luciferáz riportergént fejez ki, mind RNS, mind fehérje szinten könnyen detektálható, így egyedi lehetőséget nyújt a lokális PMH jelátvitel közvetlen, specifikus és kvantitatív meghatározására akár élő állatban is.

Elnyert szabadalmak:

- Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala HU230964. Pajzsmirigyhormon hatás mérésére szolgáló transzgenikus indikátor egér és rekombináns DNS-konstrukció. 2019

- European Patent Office EP3223606. Transgenic mouse for the assessment of thyroid hormone (TH) action. 2019

- United States Patent and Trademark Office 10,694,724 B2. Transgenic mouse for the assessment of thyroid hormone (TH) action. 2020

Az intézetünkben működő In vivo képalkotó laboratórium lehetővé teszi, hogy a THAI egérmodellben, élő állatban tanulányozzzuk a lokális PMH háztartást. A készülék segítségével a THAI egér luciferáz riportere által generált biolumineszcens fény altatott, élő állatban mérhető. Ezt a mérési módot is használjuk, hogy olyan szerek hatását tanulmányozzuk, melyek potenciálisan zavarják a PMH hatást, például endokrin diszruptorként számon tartott műanyag adalékok.

Bár a D2 expressziós szintjének meghatározása elterjedt mód a PMH sejten belüli aktivációjának jellemzésére, az enzim összetett fehérje szintű szabályozása miatt ez gyakran pontatlan lehet. Magyarosrszágon egyedülálló módon laboratóriumunk rutinszerűen méri állati és human eredetű minták kettes típusú dejodáz (D2) aktivitását ¹²⁵I izotóppal jelölt szubsztráttal. Részesei vagyunk a European Thyroid Association a PMH metabolizmus mérését sztenderdizáló konzorciumának.

Csoportunk rutinszerűen használ az állatfelhasználás csökkentése és a pontos molekuláris mechanizmusok tanulmányozására immortalizált sejtkultúrákat. Használunk továbbá primer idegrendszeri asztrocita, neuronális és tanicita sejttenyészetet is a kortikális és hipotalamikus PMH jelátvitel mehanizmusiamak tanulmányozásához.

Mind primer, mind immortalizált sejtkultúrákon végzett transzfekciós kísérleteink fő eszköze az álatlunk kifejlesztett csaknem ezerféle DNS konstrukciót magában foglaló könyvtárunk. E konstrukciók képezték számos transzgenikus állatmodellünk (például a THAI egér) alapjait is.

A PMH elsődleges hatása a génaktivitáson mutatkozik meg, ezért kiemelten fontos, hogy a géntermék mennyiségét elemezni tudjuk. Ehhez sztenderdizált Taqman kvantitatív PCR technikát, valamint kézi és automatizált kapilláris Western Blot módszert használunk. Ezek segítségével a PMH közvetlen hatását és annak fehérje szintű következményeit is vizsgálni tudjuk akár mikrodisszektált agyrégiókból, mint például hipotalamikus almagokból.